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神經(jīng)調(diào)節(jié)素受體降解蛋白(Nrdpl)在老年大鼠體外循環(huán)導(dǎo)致的術(shù)后認(rèn)知功能障礙中的作用及機(jī)制研究
摘要
目的：通過(guò)建立老年大鼠體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB) 導(dǎo)致的術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunctions，POCD)
模型，初步探討老年大鼠CPB后POCD及海馬神經(jīng)元凋亡與神經(jīng)調(diào)節(jié) 素受體降解蛋白(Nrdpl)的相關(guān)性。通過(guò)慢病毒構(gòu)建空載質(zhì)粒、Nrdpl 過(guò)表達(dá)及沉默海馬神經(jīng)元細(xì)胞，探討Nrdpl在缺氧復(fù)氧模型中對(duì)神經(jīng) 元細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用；并通過(guò)基因干擾大鼠海馬Nrdpl的表達(dá)，在 載體水平探討Nrdpl對(duì)老年大鼠CPB后POCD的影響及其發(fā)揮作用的 調(diào)控機(jī)制是否與Nrdpl泛素化降解底物蛋白ErbB3及下游AKT信號(hào)通 路，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡有關(guān)。
方法：
第1部分
選取18月齡SD (Sprague-Dawley，SD)雄性大鼠60只，按照隨 機(jī)數(shù)字表法分為三組（n=20)，即對(duì)照組（C組)、假手術(shù)組（S組)、 模型組（M組）。建模前對(duì)老年大鼠進(jìn)行為期5天的行為學(xué)基線(xiàn)測(cè)試及 Morris水迷宮訓(xùn)練。C組做為空白對(duì)照組，S組大鼠只做對(duì)應(yīng)的血管結(jié) 扎，而未進(jìn)行CPB，M組為CPB組。通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀(guān)察三 組老年大鼠術(shù)后第1、3、7天行為學(xué)的改變，包括1.定位巡航實(shí)驗(yàn)（測(cè)
量逃逸潛伏期和游泳速度)、2.空間探索實(shí)驗(yàn)（測(cè)量停留時(shí)間百分比和 停留路程百分比），以評(píng)價(jià)CPB對(duì)學(xué)習(xí)、記憶功能的影響。造模結(jié)束 后，通過(guò)使用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)檢測(cè)C、S、M三組大鼠在CPB后第1、3、7天海馬組織中炎 因子TNF-a、IL-lp的含量。用Westem-blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)C、S、M三 組大鼠CPB后海馬組織中Nrdpl、ErbB3、p-AKT、C.Caspase3的表達(dá) 水平。通過(guò) TUNEL 染色法（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL)，分別觀(guān)察 C、S、M 三組大鼠海馬 CA1、 CA3、DG區(qū)的神經(jīng)元凋亡情況，并計(jì)算其凋亡指數(shù)。
第二部分
體外培養(yǎng)海馬原代神經(jīng)元細(xì)胞，采用重組克隆技術(shù)，在細(xì)胞培養(yǎng) 的第5天將慢病毒轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)所得的海馬原代神經(jīng)元，構(gòu)建特異性 Nrdpl過(guò)表達(dá)組、特異性Nrdpl沉默組以及空載質(zhì)粒組海馬神經(jīng)元。慢 病毒轉(zhuǎn)染72小時(shí)后構(gòu)建細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，將海馬原代神經(jīng)元按照隨 機(jī)數(shù)字表法分為5組：空白對(duì)照組（C組)、缺氧復(fù)氧組（H/R組)、空 載質(zhì)粒缺氧復(fù)氧組(H/R+NC組)、Nrdpl過(guò)表達(dá)缺氧復(fù)氧組(H/R+Nrdpl 組）、Nrdpl 沉默缺氧復(fù)氧組(H/R+shNrdpl 組）〇Westernblot檢測(cè)Nrdpl、 ErbB3、p-AKT、AKT和C.Caspase3蛋白的變化情況。采用MTT法檢 測(cè)神經(jīng)元的活性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)神經(jīng)元的凋亡情況。
第三部分
選取18月齡SD雄性大鼠60只。15只大鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)顱 腦定位儀將慢病注射大鼠海馬CA1區(qū)，構(gòu)建空載質(zhì)粒、Nrdpl 過(guò)表達(dá)及沉默大鼠。剩余45只大鼠實(shí)施CPB手術(shù)，隨機(jī)分為5 組（n=9):空白對(duì)照組（C組）、體外循環(huán)組（M組)、空載質(zhì)粒體外 循環(huán)組（M+NC組)、Nrdpl過(guò)表達(dá)體外循環(huán)組（M+Nrdpl組)、Nrdpl 沉默體外循環(huán)組（M+shNrdpl組)。通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀(guān)察五組老 年大鼠術(shù)后行為學(xué)的改變，包括1.定位巡航實(shí)驗(yàn)、2.空間探索實(shí)驗(yàn)，以 評(píng)價(jià)CPB對(duì)學(xué)習(xí)、記憶功能的影響。TUNEL熒光染色，觀(guān)察各組大 鼠海馬CA1區(qū)的海馬神經(jīng)元凋亡情況。Western blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)五組 大鼠在 CPB 后海馬組織中 Nrdpl、ErbB3、p-AKT、AKT 和 C.Caspase3 蛋白的變化情況。
